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发表在“NATURECOMMUNICATIONS”，影响因子12.
地中海贫血是一种血红蛋白合成障碍疾病。β-地中海贫血是最常见和最严重的形式，是由于正常β-珠蛋白肽链的缺乏或减少导致的。从病理生理学上解释β-地中海贫血是由于α/β-珠蛋白肽链的表达量失衡引起，过量的游离α-珠蛋白肽链导致无效的红细胞生成和溶血。有研究发现，同时遗传有α-地中海贫血与β-地中海贫血，可减少游离α-珠蛋白肽链，从而减轻贫血症状。
α-珠蛋白基因的表达是由位于10-50kb的基因上游的四个增强子（MCS-R1至R4）控制的。近期，报道了一个稀有的3.3kb缺失的纯合子的病人（MC），其独特地缺失了其中一个增强子MCS-R2，其结果是α-珠蛋白基因的表达显著下调，并表现出α-地中海贫血症状。因此，作者推测，如果针对性的突变增强子MCS-R2，使α-珠蛋白表达下调，将有利于β-地中海贫血患者减轻症状。
解读专栏
01研究思路1）作者通过分析一个MCS-R2缺失的家系，证实MCS-R2是α-珠蛋白的增强子；
2）通过CRISPR/Cas9技术敲除CD34+细胞的MCS-R2核心区（~bp），可使α-珠蛋白的表达明显下调；
3）使用异种移植实验，证实基因编辑的造血干细胞（HSC）保留了长期的再生能力；
4）最终他们在β-地中海贫血患者的CD34+细胞中敲除MCS-R2，发现恢复了β-地中海贫血细胞中的珠蛋白量的平衡。
02研究过程1）一个天然的缺失，其独特的除去了MCS-R2增强子
作者发现了一个MC的家系，其独特的失去了MCS-R2增强子。接下来作者对患者的血红蛋白、红细胞及外周血进行了分析，均发现其表现异常，证明其是α-地中海贫血症。根据以往的研究作者发现MCS-R2增强子在α-珠蛋白基因表达中是最强大的增强子。作者通过hChIP-seq分析进一步证实MC患者的DNA上不存在MCS-R2核心片段。
2）在体外靶向敲除MCS-R2，使α-珠蛋白表达下调
作者在体外使用CRISPR/Cas9技术对正常人的CD34+细胞进行基因编辑，以敲除MCS-R2，使α-珠蛋白表达下调。作者设计了四对sgRNA，然后转染CD34+细胞，通过流式及PCR分析，发现有三对CRISPR/Cas9质粒的切割活性较强。通过Sanger测序证实其敲除了MCS-R2的核心区（约bp）。将转染成功的CD34+细胞分化为红细胞以评估珠蛋白基因表达，结果证实α-珠蛋白表达明显下调。
3）单细胞克隆分析证实纯合敲除MCS-R2可使α-珠蛋白表达明显下调
图A表示在7种三阴性乳腺癌细胞中不同sgRNA导入细胞后荧光减少的百分比变化。由图可知，在这7种细胞中，敲除对细胞必需的基因，如RPA3和PCNA，在传代过程中，荧光有明显的降低，减少倍数为5-倍不等，这种差异可能原因是不同sgRNA的活性不等以及靶标区域在基因功能中发挥的重要性不同。而敲除MELK基因，同Rosa26基因一样，荧光没有明显减少，减少倍数不超过2倍。图B是A图中的结果的统计。
作者选择CRISPR质粒对（Cr2+Cr12）转染了CD34+细胞，通过流式得到单克隆细胞。将单克隆细胞分化为红细胞，测定每个克隆的基因型和珠蛋白基因表达。通过PCR和测序对这些克隆进行基因型分析发现,得到不同比例MCS-R2的杂合缺失、纯合缺失、反转及未知的突变。通过qPCR分析发现，MCS-R2纯合缺失的α/β-珠蛋白mRNA的比例明显减少。并且使用Sanger离靶测试工具,结果显示基因编辑克隆的DNA测序并没有发现脱靶。则此方法较安全可靠。将有望成为治疗β-地中海贫血一种有效的方法。
4、基因编辑的HSC保留了长期的再生能力
作者使用CRISPR转染的CD34+细胞，通过流式得到编辑成功的CD34+细胞，将其注射到免疫缺陷的小鼠骨髓中，12周后收集骨髓，通过流式从这些骨髓获得的人CD45+细胞。将CD45+细胞注射到免疫缺陷的小鼠骨髓中，在2/3小鼠中发现了多系hCD45+细胞的移植。作者还对从二次移植小鼠收获的CD45+中的CD34+细胞进行分化实验，结果可得到粒细胞/巨噬细胞和红细胞。说明基因编辑的HSC保留了长期的再生能力。
5、敲除MCS-R2可恢复β-地中海贫血细胞中的珠蛋白的平衡
作者使用（Cr2+Cr12）质粒对将β-地中海贫血患者的CD34+细胞进行基因编辑，通过分析发现有不同的类型的突变。将CD34+细胞分化为红细胞，通过qPCR分析红细胞的α/β-珠蛋白mRNA比例及α/(β+γ)珠蛋白mRNA比例。可发现纯合缺失MCS-R2，可使α珠蛋白的mRNA明显下调。再次证明α-珠蛋白表达下调，将有利于β-地中海贫血患者。
03研究结论及意义使用CRISPR/Cas9系统编辑的原代人造血干细胞/祖细胞（CD34+），可靶向的高效敲除控制α-珠蛋白基因表达的MCS-R2，并对实验中使用的基因组编辑工具进行脱靶效应的测试，其结果显示没有任何脱靶。异种移植测定显示，编辑的CD34+细胞有一定比例是长期的再生造血干细胞（LT-HSC），证明了这种方法具有治疗β-地中海贫血的潜力。这些发现开辟了一种新的方法来改善这种限制生命的疾病，并为一般的人类遗传疾病提供了有益的见解。
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稿件来源：技术中心王利英
稿件编辑：GEMPLE捷易市场部
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