CRISPR
技术
TreatmentUpdate
与DMD
.5.17
导语
人类在真核生物的演化道路上走了如此之久，却回过头来从古细菌里找到了破解基因疾病的办法。达尔文可能难以相信，人类有一天能按照自己的心愿修改基因。CRISPR技术做到了。
——编者按
点击边框调出视频工具条ThecuttingedgeofCRISPR—AlifesavingtreatmentforDMD
Hi，大家好，本期由（并没有像本·杜普里一样获得生物化学学士学位）的小编带来CRISPR技术治疗杜氏肌营养不良（DMD）的进展。内容已经属于高阶阅读范围了，如果您想真正了解这些技术的原理和应用前景，如果你想知道每种治疗方法的优点和缺点，如果你想知道哪一种方法最适合自己，就试试和我一起看完上面这个视频并且读完全文。里面的内容涉及许多专业名词，我尽量选择了通俗的语言进行描述，大家如果有不懂的内容可以留言，我们将在随后推出相关名词概念的解释。
01什么是CRISPR？
壹
细菌在病毒侵入时，会将病毒遗传物质特异性地储存在常规聚集性间隔性短回文重复序列（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR）里，为下次病毒的病毒攻击提供识别机制，配合Cas9（CRISPRassociatedprotein9）核酸酶对病毒进行摧毁。是细菌版本的“记忆性免疫”。
图1.细菌的适应性防御机制
经过改造的CRISPR成为了基因编辑工具，由向导sgRNA（singleguideRNA,sgRNA)和配套的Cas9核酸酶组成，可以根据需求对sgRNA进行编码，从而将Cas9核酸酶导向生物的任意基因片段进行修改。目前，CRISPR疗法已经进入了临床试验，治疗白血病、淋巴瘤、β-地中海贫血，镰状细胞贫血和莱伯先天性黑朦等。
02
贰
CRISPR治疗杜氏肌营养不良症的优势有哪些？
突变类型集中：目前已知的DMD致病突变有多种，外显子缺失约占2/3，是致病突变中最主要的类型。其余突变大多数也聚集在热点区域内。纠正热点范围内的突变可以治疗60％的患者。如果将不常见突变也囊括进去，治疗范围可以扩大到80％的患者人群。
图2.DMD外显子突变的主要类型
突变的基因具有保守性：人类和小鼠的肌营养不良蛋白外显子剪接模式保守性极高，因此可以将小鼠的外显子研究推广到人类基因范畴。
基因结构的特殊性：肌营养不良蛋白的杆结构域（Roddomain）是模块化结构，正常蛋白表达只需CRISPR技术删除该区域内的突变外显子并恢复开放阅读框。
病人群体的特殊优势：肌营养不良蛋白基因仅在X染色体上存在。DMD患者（多为男性）只需要纠正一个突变等位基因，并且不会破坏野生型等位基因。
由于骨骼肌是一个合胞体，成百上千的细胞核可以共享一个共同的细胞质。因此，哪怕只有极少数细胞的基因被矫正，产生少量正常肌营养不良蛋白，就能达到DMD治疗效果。研究者们预估，只需要进行15%的基因修正，就能使肌营养不良蛋白达到正常水平（25%）。
03
CRISPR治疗DMD的策略是什么？
叁
图3.CRISPR治疗DMD外显子突变的主要策略
对于小鼠模型来说，可以向受精卵注射CRISPR/Cas9基因编辑组件来纠正突变的外显子。也可以对出生后的小鼠采用腺病毒注射法，利用腺病毒搭载基因编辑组件在体内进行外显子的跳跃或者删除编辑。两种方法都能恢复肌营养不良蛋白的表达并改善肌肉功能。
（1）删除突变的外显子：以目标外显子的两侧基因编码两个sgRNA，与Cas9一起切除单个或多个突变外显子，拼接相邻框内的外显子从而恢复开放阅读框。也可用于外显子重复突变，将单个sgRNA靶向重复外显子之间相邻的内含子区域，Cas9会产生两个切割来剪掉一个复制的外显子，从而续接开放阅读诓，并产生具有正常功能的肌营养不良蛋白。
（2）跳过突变的外显子：跳过策略会导致肌营养不良蛋白长度缩短，但保留一半的功能，因此可以减轻DMD症状。在约83％的DMD患者中，可以用跳跃策略来代替突变外显子删除。跳过一个或多个外显子以恢复肌营养不良蛋白的开放阅读诓。年以来，美国食品药品监督管理局批准了针对51号外显子的基于反义寡核苷酸的外显子跳跃疗法。该疗法仅修饰了肌营养不良蛋白mRNA，但是基础突变仍然存在肌营养不良蛋白基因。患者必须终生每两周服用一次这种药物。相比之下，CRISPR基因编辑治疗可能“一劳永逸”，因为这项技术可以纠正基因组中的突变。
（3）重构突变的外显子：该策略基于基因的非同源末端连接的重构。使用sgRNA诱导框外外显子中的非同源末端连接，有1/3的可能性将肌营养不良蛋白基因重新移回阅读框内。因此该策略是在绕过DMD突变并且保留肌营养不良蛋白基因组序列的最有效方法。
（4）敲入正常外显子：外显子敲入策略使用CRISPR诱导的同源介导的修复，可以将靶向基因替换成外源性的正常基因，从而恢复全长的肌营养不良蛋白。不过这种策略携带外源基因片段的能力有限，治疗大片段缺失突变比较困难，并且受制于细胞的分裂周期。最近开发的同源性无关的靶向整合（HITI），可以将靶向基因插入非分裂细胞中。
图4.碱基编辑和基因调节
（5）CRISPR也可以进行碱基编辑，以解决25–35％DMD患者的点突变。碱基编辑可以将C：G碱基对为T：A，也可以将A：T碱基对转换为G：C。这些RNA引导的核苷酸特异性碱基编辑器由胞嘧啶脱氨酶，或经工程改造的腺嘌呤脱氨酶与Cas9切口酶（nCas9）或催化缺陷的Cas9（dCas9）融合而成，不会产生Cas9介导的DNA双链断裂，并且不依赖于非同源末端连接的重构的修复途径。
（6）基因调节：通过使用dCas9（一种失活形式的Cas9）与转录激活因子或阻遏因子融合，CRISPR技术也可以调控转录的上调或下调。
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肆
目前的CRISPR治疗DMD的研究进展有哪些？
首先，我们可以读一读EricN.Olson博士发表在ScienceAdvances上的文章EnhancedCRISPR-Cas9correctionofDuchennemusculardystrophyinmicebyaself-
